信息摘要：
建立中药配方颗粒所含难溶性物质和高分子化合物的红外光谱分析方法。方法：将中药配方颗粒样品溶于热水，分离沉淀，溶液部分用三氯甲烷萃取，剩余水层进行醇沉处理。红外光谱检测不同溶剂分离部位，通过官能团解析、化合物比对等识别难溶性物质和高分子化合物。结果：本研究所使用中药配方颗粒均检出高分子辅料，普遍添加麦芽糊精，个别含聚氧化乙烯。中药配方颗粒的难溶性物质较为复杂，有硅胶、硬脂酸钙、麦芽糊精等辅料成分，也有草酸盐、硅酸盐、蛋白质、多糖等饮片成分。有些配方颗粒会同时添加多种辅料。结论：红外光谱结合溶剂分离可以快速检测中药配方颗粒所含难溶性物质和高分子化合物，识别辅料种类，为中药配方颗粒质量评价提供更丰富的化学成分信息。...
建立中药配方颗粒所含难溶性物质和高分子化合物的红外光谱分析方法。方法：将中药配方颗粒样品溶于热水，分离沉淀，溶液部分用三氯甲烷萃取，剩余水层进行醇沉处理。红外光谱检测不同溶剂分离部位，通过官能团解析、化合物比对等识别难溶性物质和高分子化合物。结果：本研究所使用中药配方颗粒均检出高分子辅料，普遍添加麦芽糊精，个别含聚氧化乙烯。中药配方颗粒的难溶性物质较为复杂，有硅胶、硬脂酸钙、麦芽糊精等辅料成分，也有草酸盐、硅酸盐、蛋白质、多糖等饮片成分。有些配方颗粒会同时添加多种辅料。结论：红外光谱结合溶剂分离可以快速检测中药配方颗粒所含难溶性物质和高分子化合物，识别辅料种类，为中药配方颗粒质量评价提供更丰富的化学成分信息。
中药配方颗粒是由单味中药饮片经水加热提取、分离、浓缩、干燥、制粒而成的颗粒[1]。服用方便、调配灵活等优势赋予中药配方颗粒广阔的发展前景[2]，而可靠的质量保证是必备前提。因为失去了中药饮片的性状和显微特征，化学成分检测是中药配方颗粒质量评价的关键手段[3]。中药配方颗粒制备时需以水为溶媒加热提取[1]，但是现有质量标准主要使用色谱方法检测其中可溶于有机溶剂的小分子化合物[4][5][6]，缺少针对其他类型成分的化学表征，不能全面整体地评价中药配方颗粒的物质组成。
中药配方颗粒制备时可以使用必要的辅料[1]。辅料种类和用量可能影响服药剂量、药物溶出和吸收等[3,7][3,7]，是中药配方颗粒质量评价时应考虑的因素。中药颗粒剂常用辅料多为高分子和无机物，难以直接体现在基于液相色谱或气相色谱的指纹图谱或特征图谱中。中药饮片水提物可能含有多糖、蛋白质等高分子化合物，有些情况下这些成分是重要药效物质。因此，高分子化合物检测对于中药配方颗粒质量评价是很有必要的。中药配方颗粒冲服时可能存在难溶性物质[3]。这些难溶性物质可能是没有除净的饮片残渣，或者是人为添加的难溶性辅料，还可能是因为后续生产过程降低了某些成分的溶解性。因此，难溶性物质检测对于中药配方颗粒质量评价很有必要。
波数为4000～400 cm–1的中红外光谱（《中华人民共和国药典》称为“红外分光光度法”，以下简称红外光谱）是固体样品、高分子样品的经典分析方法之一，可用于中药配方颗粒的难溶性物质与高分子化合物检测。红外光谱可以直接检测固体、液体、气体等各种形态物质，能够同时获得有机小分子、有机大分子、无机成分等各类成分信号，从而快速且整体地表征中药配方颗粒的物质组成[8][9][10][11][12]。但是，样品未经分离而直接进行红外光谱检测时，不同成分的光谱信号相互叠加，降低了灵敏度和专属性。因此，本研究尝试先对样品进行溶剂分离，然后用红外光谱检测不同溶剂分离部位，获得中药配方颗粒所含难溶性物质和高分子化合物的化学组成信息。
1 材料
1.1 样品
中药配方颗粒样品由生产厂家A、B、C、D提供（表1）。茯苓饮片（批号：20200409，北京上医仁家中医诊所有限公司）经鉴定为多孔菌科真菌茯苓Poria cocos (Schw.)Wolf的干燥菌核。
表1 中药配方颗粒样品信息
1.2 试药
硬脂酸钙（批号：C12785783，钙质量分数6.6%～7.4%）、干法云母粉（批号：C13718326,1250目）购自上海麦克林生化科技股份有限公司；硅胶（批号：C2204266，分析纯，300～400目）、聚氧化乙烯（PEO，批号：C2211203，黏度平均分子质量约100万）、草酸钙水合物（批号：J1816073，纯度98%）均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；麦芽糊精[葡萄糖当量（DE）≤18]。
1.3 仪器
傅里叶变换红外光谱仪，配有Platinum ATR衰减全反射附件；Milli-QⓇIntegral 5型纯水系统；BT25S型十万分之一电子分析天平（德国Sartorius公司）；KH7200DB型数控超声波清洗器）；3-18N型台式高速离心机。
2 方法
2.1 中药配方颗粒溶剂分离
如图1所示，使用溶剂分离法获得各配方颗粒样品的难溶部位、三氯甲烷部位、乙醇部位、水溶部位，挥干或冻干除去溶剂后进行红外光谱测试。
2.2 红外光谱测试与数据处理
适量水或乙醇清洁ATR附件的内反射晶体表面，溶剂挥干后测量背景光谱；然后取样品适量，置于内反射晶体表面，用ATR附件自带压杆保证样品与内反射晶体表面紧密接触，测量样品光谱。背景光谱与样品光谱测量范围4000～400 cm–1，光谱分辨率4 cm–1，单张光谱累积扫描32次。以透过率（T）为纵坐标记录样品光谱测量结果，然后进行如下处理：1）使用光谱仪配套软件的插值功能将所有光谱横坐标间隔调整为1 cm–1;2）光谱纵坐标由T转为吸光度[A,A=lg(1/T)];3）对光谱进行ATR校正；4）对光谱进行自动基线校正；5）光谱纵坐标归一化，使2000～800 cm–1区域内最高吸光度为1、最低吸光度为0。
图1 中药配方颗粒样品的溶剂分离方法
3 结果与讨论
3.1 中药配方颗粒难溶部位的红外光谱分析
当归-A、党参-A、党参-C、黄芪-C 4个配方颗粒样品的难溶部位与硅胶（SiO2·xH2O）的红外光谱见图2。硅胶的红外光谱中1068、456 cm–1分别为Si-O伸缩振动和弯曲振动吸收峰，3385、1628 cm–1分别为O-H伸缩振动和弯曲振动吸收峰。结合水的影响使硅胶Si-O吸收峰与无水二氧化硅有明显差异。厂家A当归和党参配方颗粒、厂家C党参和黄芩配方颗粒的难溶部位红外光谱与硅胶一致，说明这些配方颗粒中可能添加了微粉硅胶作为辅料。
几种配方颗粒的难溶部位与草酸钙水合物（CaC2O4·xH2O）的红外光谱见图3。草酸钙水合物的红外光谱中1613、1315 cm–1分别为羧酸根离子C-O反对称和对称伸缩振动吸收峰，3500～3000 cm–1区域为结晶水O-H伸缩振动吸收峰。厂家B党参配方颗粒、厂家D当归和金银花配方颗粒的难溶部位红外光谱中1640、1320 cm–1附近吸收峰与草酸钙水合物相似，但并非完全一致。这可能是因为结晶水比例不同，或者阳离子有差异。草酸钙难溶于水，中药饮片水提物中草酸钙含量应该极低。另外，上述配方颗粒难溶部位的红外光谱中也有1080、460 cm–1附近的硅胶特征峰，但是1200～1000 cm–1区域的峰形状有一定差异，说明这些样品中可能含有硅酸盐杂质。上述配方颗粒产品中同时存在难溶性草酸盐与难溶性硅酸盐，可能是因为生产过程中提取液没有充分滤净。
图2 含有硅胶的中药配方颗粒难溶部位的红外光谱
图3 含有草酸盐的中药配方颗粒难溶部位的红外光谱
如图4所示，厂家B当归配方颗粒、厂家D党参配方颗粒的难溶部位红外光谱均含有1640 cm–1附近的酰胺Ⅰ带峰和1530 cm–1附近的酰胺Ⅱ带峰，说明其中均含有蛋白质类成分，可能是浸膏中可溶性蛋白质在后续生产过程（如干燥过程）发生变性。此外，厂家B当归配方颗粒难溶部位含有麦芽糊精，也说明其生产过程可能导致多种成分溶解性变化。上述2个配方颗粒难溶部位红外光谱均有1320 cm–1附近的草酸盐吸收峰，但是1640 cm–1附近的草酸盐吸收峰与蛋白质酰胺Ⅰ带峰相互重叠。厂家D党参配方颗粒难溶部位的524、469 cm–1吸收峰显示了硅酸盐的存在。硅酸盐（523、464 cm–1）与硅胶（456 cm–1）特征峰有明显区别，这说明厂家D党参配方颗粒中应当没有添加微粉硅胶，而是可能因为固液分离不净而在浸膏中遗留有难溶性硅酸盐。
图5显示了A、B、C 3个厂家生产的茯苓配方颗粒的难溶部位红外光谱。对照图4显示的麦芽糊精红外光谱可知，厂家C茯苓配方颗粒难溶部位主要是麦芽糊精。比较1200～900 cm–1区域的红外光谱吸收峰特征可知，A和B 2个厂家的茯苓配方颗粒难溶部位与茯苓饮片相似，主要由难溶性的β-葡聚糖组成，而890 cm–1附近即为典型的β-葡萄糖苷键特征峰[13]。这说明A和B 2个厂家的茯苓配方颗粒可能含有固液分离不净或其他原因遗留的难溶性饮片粉末。此外，厂家B茯苓配方颗粒难溶部位红外光谱还有明显的1610、1313、779 cm–1等草酸钙水合物特征峰，也说明其产品中可能遗留有难溶性饮片粉末。
图4 含有蛋白质的中药配方颗粒难溶部位的红外光谱
图5 含有多糖的中药配方颗粒难溶部位的红外光谱
图6所示为几种配方颗粒的难溶部位与硬脂酸钙（CaC36H70O4）的红外光谱。硬脂酸钙的红外光谱中2916、2849 cm–1分别为亚甲基C-H反对称和对称伸缩振动吸收峰，1600～1400 cm–1区域为羧酸根离子C-O伸缩振动吸收峰与亚甲基和甲基C-H弯曲振动吸收峰的重叠结果。厂家A和厂家C的金银花配方颗粒、厂家D黄芪配方颗粒的难溶部位红外光谱中2916、2849 cm–1附近吸收峰与硬脂酸钙基本一致，厂家D黄芪配方颗粒难溶部位红外光谱中能直接观察到1576、1540 cm–1附近的硬脂酸钙特征峰，说明这些样品均添加硬脂酸钙作为辅料。
图6 含有硬脂酸盐的中药配方颗粒难溶部位的红外光谱
综上所述，中药配方颗粒产品中普遍存在难溶性物质，而且化学组成较为复杂，不同厂家、不同品种的中药配方颗粒难溶性物质各有差异。一些难溶性物质来自辅料，如硅胶、硬脂酸钙、麦芽糊精等；另一些难溶性物质来自饮片，如草酸盐、硅酸盐、蛋白质、多糖等。饮片提取后的生产环节可能改变原有可溶性成分的溶解度，也可能因为固液分离不净等导致配方颗粒产品含有原本存在于饮片中的难溶性成分。
3.2 中药配方颗粒三氯甲烷部位的红外光谱分析
中药配方颗粒水溶液以极性分子为主，所以大部分样品的三氯甲烷萃取液中固形物极少，仅含有一些甲基、亚甲基较多的分子。但是，如图7所示，厂家D黄芪配方颗粒三氯甲烷部位的红外光谱与PEO高度一致，说明该配方颗粒中添加了PEO作为辅料。本研究过程中发现，该厂家其他批次的黄芪配方颗粒也存在添加PEO的情况。
3.3 中药配方颗粒水溶部位的红外光谱分析
麦芽糊精是中药配方颗粒普遍添加的辅料，部分产品中麦芽糊精含量超过50%。中药配方颗粒不经分离而直接进行红外光谱检测时，借助化学计量学方法可以比较准确地定量检测其中的麦芽糊精[14][15]。如果样品中麦芽糊精含量较低而且没有可用的多元校正模型，可以利用溶剂分离方法提高红外光谱定性检测麦芽糊精的灵敏度。中药配方颗粒水溶液的醇沉沉淀（本研究中称为水溶部位，图1）是多糖类成分较为富集的部位，因此是检测麦芽糊精或其他多糖类成分的首选。如图8所示，不同品种配方颗粒的水溶部位红外光谱均与麦芽糊精非常相似，说明中药配方颗粒普遍添加麦芽糊精，而且麦芽糊精含量明显超过中药自身多糖含量。如果要检测中药配方颗粒所含的药物多糖，必须排除麦芽糊精的影响。
图7 含有PEO的中药配方颗粒三氯甲烷部位的红外光谱
图8 含有麦芽糊精的中药配方颗粒水溶部位的红外光谱
3.4 典型配方颗粒样品的不同溶剂部位红外光谱分析
厂家D黄芪配方颗粒不同溶剂部位的红外光谱见图9。配方颗粒样品不经分离而直接进行检测时，其红外光谱是全部成分吸收信号的叠加，含量较高、信号较强的成分占据主导，含量较低、信号较弱的成分不易观察。由图9可知，该黄芪配方颗粒整体红外光谱的主要吸收信号来自乙醇部位，也就是既溶于水、又溶于70%乙醇的小分子化合物。该黄芪配方颗粒乙醇部位的红外光谱与无定形蔗糖非常相似，液相色谱测试发现该黄芪配方颗粒的蔗糖质量分数达到30%。因此，可以基本确定该黄芪配方颗粒整体与乙醇部位的红外光谱主要特征与无定形蔗糖一致。根据厂家D提供的数据，该黄芪配方颗粒中麦芽糊精含量为29%。但是麦芽糊精的红外光谱吸收信号区域与蔗糖高度重叠，所以在该配方颗粒整体红外光谱上很难直观发现麦芽糊精特征峰，而水溶部位的红外光谱与麦芽糊精（图8）高度相似。该黄芪配方颗粒的难溶部位明显含有硬脂酸钙（图6），而三氯甲烷部位明显含有PEO（图7）。虽然硬脂酸钙与PEO的含量较低，但是该配方颗粒整体红外光谱上仍然可以观察到2918 cm–1附近的硬脂酸钙特征峰与1341 cm–1附近的PEO特征峰。综上所述，厂家D黄芪配方颗粒的整体红外光谱显示其含有大量无定形蔗糖，还可能添加硬脂酸钙与PEO。溶剂分离后的红外光谱可以确认硬脂酸钙与PEO的存在，还可以确认麦芽糊精的存在。
图9 某黄芪配方颗粒不同溶剂部位的红外光谱
4 结论
中药配方颗粒可以看作单味中药饮片水提物与辅料的混合物。基于液相色谱或气相色谱检测技术的指纹图谱（特征图谱）是对中药配方颗粒所含有机小分子化合物进行整体控制的必备手段。此外，中药配方颗粒含有的难溶性物质、高分子化合物可能影响有机小分子化合物的溶出、溶解、吸收过程，某些情况下难溶性物质、高分子化合物本身就属于药效物质。因此，建立难溶性物质与高分子化合物的化学表征方法，对于更加全面整体地评价中药配方颗粒质量是较为必要的。根据红外光谱能够直接检测固体样品和高分子样品的技术特点，本研究选择红外光谱表征中药配方颗粒难溶性物质与高分子化合物的化学结构。为了提高检测灵敏度和专属性，本研究采取先用系统溶剂分离、后用红外光谱检测的技术路线。
本研究的结果表明，红外光谱与系统溶剂分离相结合可以明显提高检测灵敏度和专属性，有效识别中药配方颗粒所含难溶性物质与高分子化合物。三氯甲烷部位的红外光谱可以发现亲脂性高分子辅料（如PEO），而水溶部位的红外光谱可以发现亲水性高分子辅料（例如麦芽糊精）。难溶部位的红外光谱既可以发现硅胶、硬脂酸钙等无机辅料，又可以发现草酸盐、硅酸盐、蛋白质、多糖等药物自身成分，反映了分离、干燥、制粒等生产环节对中药配方颗粒药物组成及其理化性质的影响。因此，红外光谱可以与液相色谱、气相色谱等分析技术相互结合，更加全面地表征中药配方颗粒的化学成分，更加完善地评价中药配方颗粒的质量水平。
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